عنوان اختراع: ساخت کیت سرولوژیکی DAS-ELISA با استفاده از پروتئین نوترکیب جهت ردیابی بیماری جاروک لیموترش

خلاصه اختراع

‏بیماری جاروك لیمو ترش یكی از مخربترین بیماریهای لیموترش در مناطق گرم جنوبی كشور می باشد كه هزاران درخت را سالیانه در این مناطق نابود می كند‏. با توجه به عدم دسترسی به روش كنترلی مناسب بر علیه این بیماری و همچنین با توجه به اینكه این بیماری در حال حاضر محدود به نواحی جنوبی كشور بوده، امحاء كانون های آلودگی و جلوگیری از حمل و نقل مواد گیاهی آلوده از جمله مهمترین اقدامات در دست اجرای وزارت كشاورزی و سایر نهاد های ذیربط در این مسئله میباشد. بنابراین دسترسی به یك روش تشخیص با دقت و حساسیت بالا كه قابلیت انجام در مناطق دورافتاده ‏و با حد اقل امكانات را دارا باشد از جمله مهمترین نیاز های اولیه در این خصوص میباشد. در اینجا كیت سرولوژی DAS-ELISA ‏جهت تشخیص دقیق و سریع نمونه های آلوده تولید گردیده است كه قابلیت استفاده در آزمایشگاه هایی با حداقل ‏امكانات را دارا میباشد. در این تحقیق پروتئین Imiliunodominant ‏( membrane protein (IMP ‏ موجود در سطح غشا فیتوپلاسما به عنوان هدف جهت شناسائی این بیماری انتخاب گردیده است. با استفاده از منابع اطلاعاتی ژنتیكی در ابتدا پرایمر های اختصاصی ژن IMP ‏ طراحی گردید و جداسازی ژن مربوطه از گیاهان آلوده صورت پذیرفته و جهت تولید انبوه بصورت نوتركیب، در ناقل بیانی باكتریاثی p.ET28 ‏ همسانه سازی گردید. بیان پروتئین نوتركیب IMP ‏ در میزان زیاد در استرین BL21-de3 ‏ باكتری E. coli ‏ انجام گردید و خالص سازی پروتئین مربوطه در شرایط طبیعی با روش كروماتوگرافی تمایلی در ستون های حاوی رزین (Ni-NTA ‏) انجام شد. بیان موفق و مراحل خالص سازی بوسیله SDS-PAGE ‏ و سپس آنالیز وسترن بلات تایید گردید. پروتئین نوتركیب خالص IMP ‏برای انجام ایمنی زائی در خرگوش استفاده گردید. تزریق ها بصورت هفتگی ادامه یافته و پس از هر تزریق عیار آنتی بادی های اختصاصی تعیین گردید. هنگامی كه عیار آنتی بادی های اختصاصی به حد مطلوب رسید، خونگیری از خرگوش انجام گرفته و سپس سرم خون جداسازی گردید. بر اساس آزمون های تعیین تیتر، آخرین تیتر آنتی ‏بادی كه با آنتی ژن مربوطه واكنش اختصاصی ایجاد نمود در حد 6۵۵٣6 ‏تعیین گردید. ازمون تكمیلی وسترن با پلاتینگ جهت تایید اختصاصیت آنتی بادی های حاصله صورت گرفت كه نتاج حاصله حاكی از انجام واكنش اختصاصی با نمونه های آلوده بود. جهت ساخت كیت سرولوژیكی تشخیص DAS-ELISA ‏ ابتدا آنتی بادی های موجود در سرم خون با استفاده از از ستون پروتئین A ‏ خالص سازی گردید و پس از تایید خلوص و تعیین غلغلت جه اتصال به آنزیم آلكالین فسفاتاز مورد استفاده قرار گرفت و برای استفاده در سیستم تشخیص DAS-ELISA ‏ مورد استفاده قرار گرفت. نتایج حاصله از این آزمایش قابلیت كیت سوولوژیكی موبوطه را جهت شناسائی نمونه های آلوده گیاهی تایید نمود.