جستجو پیشرفته اختراع

خلاصه اختراع: كيموزين (رنين ، EC 3.4.23.4) يك آنزيم آسپارتيك پروتئاز مي باشد كه در شيردان نوزاد نشخواركنندگان ترشح مي گردد. اين آنزيم مولكول كاپا كازئين را به صورت اختصاصي مي شكند و سبب لخته كردن شير مي گردد بنابراين از اين آنزيم در صنعت پنيرسازي استفاده مي شود. به دليل اهميت اين آنزيم براي صنايع شير و كمبود آن، ما تصميم به توليد پروكيموزين بزي نوتركيب گرفتيم. از چند راس بزغاله ي بومي ايران، بافت شيردان بدست آمد و RNA نام آن استخراج گرديد. از روي RNA تام و به كمك آنزيم ترانس كريپتاز معكوس، cDNA تك رشته اي پري پروكيموزين بزي ساخته شد و سپس با كمك واكنش PCR از روي آن cDNA دو رشته اي ساخته شد. cDNA به دست آمده با پلاسميد pTZ57RT اتصال داده شد و توالي نوكلئوتيدي آن هم مشخص شد. سپس قطعات پروكيموزين با آنزيم هاي NdeI-EcoRI,EcoRI-EcoRI برش داده شدند و در جايگاه مناسب در پلاسميد pET-28a به نحوي قرار داده شدند كه در انتهاي آميني اين قطعات His-tag قرار بگيرد. پلاسميدهاي نوتركيب به درون باكتري E.coli BL21(DE3) ترانسفورم گرديدند و القاي بيان ژن با غلظت هاي 0/4 و يك ميلي مولار IPTG و لاكتوز در دماهاي 28، 32، 37 و 42 درجه سانتي گراد صورت گرفت. پروكيموزين نوتركيب به دو فرم محلول در سيتوپلاسم و غير محلول و به شكل Inclusion Body توليد شد كه با استفاده از ستون جاذب His-tag خالص سازي شد. نتايج نشان داده كه پروكيموزين بيشتر به فرم غير محلول و حداكثر تا 15% پروتئين تام سلولي توليد شد. پس از مراحل فعال سازي پروكيموزين نامحلول ميزان فعاليت آن اندازه گيري شد كه نتايج نشانگر فعاليت بسيار بالاي آن مي باشد. از دلايل اين فعاليت كم مي توان به وجود His-tag در انتهاي آميني پروكيموزين و ايجاد تداخل در روند فعال شدن آن اشاره كرد.